Der Apfel fällt nicht weit vom Stamm. Der Vater des am 15. November 1599 in Hamburg geborenen Arztes, Anatomen, Naturforschers und Botanikers Werner Rolfinck war Gymnasialprofessor am Johanneum der Hansestadt, der Großvater väterlicherseits gar dessen Rektor gewesen. Der Großvater väterlicherseits war Ratsherr in Buxtehude. Entsprechend gut war Rolfincks Ausbildung. 

Seine Studien begann der Norddeutsche 1615 an der Universität Rostock mit der Philosophie, die damals als Generalwissenschaft galt. 1618 gewann ihn der Mediziner Daniel Sennert an der Universität Wittenberg für seine Wissenschaft. Nach Studien ab 1618 in Leiden, Oxford und Paris sowie ab 1622 in Padua promovierte er dort zum Doktor der Medizin. 

Rolfinck blieb zunächst bei seinem dortigen akademischen Lehrer, dem Professor der Anatomie und Chirurgie Adriaan van de Spiegel, lehnte jedoch 1628 das Angebot, selbst eine Professur an der Alma Mater zu übernehmen, ab. Lieber ging er nach Deutschland zurück, wo er erst 1628 in Wittenberg und dann 1629 in Jena Professor für Anatomie wurde.

Noch im Jahre 1629 errichtete Rolfinck in Jena ein sogenanntes theatrum anatomicum, in dem er öffentliche Leichensektionen durchführte, mit denen er erhebliches Aufsehen erregte. Bei den Toten handelte es sich vor allem um hingerichtete Verbrecher. Gerechtfertigt wurden die medizinisch erkenntnisreichen Sektionen mit der unterstellten abschreckenden Wirkung auf potentielle Kapitalverbrecher. 

Ab 1631 lehrte Rolfinck auch Chirurgie und Botanik. Um diese Zeit gründete er den Botanischen Garten beziehungsweise erneuerte und erweiterte ihn um einen hortus medicus. Dahinter stand das Bestreben, seine Medizinstudenten mit der heilenden Wirkung von Pflanzen vertraut zu machen.

Außer der Botanik war Rolfinck auch die Chemie eine wertvolle Hilfswissenschaft der Medizin. Wie sein Lehrer Sennert war auch er ein Vertreter der Chemiatrie, die bestrebt ist, Lebensprozesse wie Krankheiten auf chemische Vorgänge zurückzuführen. 1638 richtete er ein chemisches Laboratorium ein und begann Chemie zu lehren. 1639 wurde er „director exercitii chymia“, zwei Jahre später Deutschlands erster Chemieprofessor. In seinem 1661 erstmals in Jena erschienenen und danach mehrmals neu aufgelegten Werk „Chymia in artis formam redacta et 6 libris comprehensa“ stellte er die Chemie in den Dienst der Medizin. Am 6. Mai 1673 starb Werner Rolfinck in seiner Wahlheimat und Hauptwirkungsstätte Jena.